Di Gianni, Pedro D. Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias Biológicas de la Universidad de Buenos Aires


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1 Tesis de Posgrado Factores inductores del estado de tumor dormido Di Gianni, Pedro D Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias Biológicas de la Universidad de Buenos Aires Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Cita tipo APA: Di Gianni, Pedro D.. (1996). Factores inductores del estado de tumor dormido. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Cita tipo Chicago: Di Gianni, Pedro D.. "Factores inductores del estado de tumor dormido". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes C1428EGA - Tel. ( ) Conta cto :

2 TRABAJO DE TESIS l.-\r.\ L.-\ OBTENCION DEL DOCTORADO DE LA [NIVERSIDAD DE Bl'ENOS AIRES TITULO : E-ICO TRES I.\'DL'CTORES DEL ES TADO DE TEMOR DORJIIDO. l TUR.' Lic. PEDRO D. (Ii (IL-{XXI me/:1 'm/e.-dr. R. IL"L RL'GGIISRO Buenas. lírex. 996

3 TITLE: FACTORS INDUCING THE TUHOR DORMANT STATE Key words: Tumor, concomitant resistance, dormant state, antitumor factor. AUTHOR: Lic. PEDRO D. di GIANNI DIRECTOR: Dr. RAUL RUGGIERÜ Buenos Aires, 1996

4 A mi Mamá. mi Papá y y a mi hermano, F\ C(lr/os C

5 AGRADECIMIENTOS A la Dra. C. D Pasqualini, por facilitar mi incorporación a la División Medicina Experimental. A las Dras. Isabel Piazon e Irene Neponasky. por su apoyo constante para la concreción de esta tesis. A la Dra. Katty, por su enorme aporte técnico y afectivo. A mis compañeros de la División Medicina Experimental, especialmente a Don Antonio. Don Juan, los Segovia, Julio y Pato. por tanto can'ño y afecto. Muy especialmente agradezco al Dr. Raúl Ruggiero, por su dirección en el trabajo y su amistad sin condicionamientos. Al Dr. Oscar Bustuoabad por ser mi maestro mas allá de la ciencia. A los amigos, Diego, Coqui. Freddy y Marilina, el Ruso, y tantos otros.

6 ML INTRODUCCION GENERAL Pag. l. CONCEPTO DE NEOPLASIA.....l l.l. Tumor Clasificacion METASTASIS ]. Definición Incidencia y mecanismo VASCULARIZACION..4 3.]. Introducción Factores inductores e inhibidores MECANISMOS RESPONSABLES DEL ESTADO DE TUMOR DORMIDO..... l l 4.1. Definición.....ll 4.2. Mecanismos RESISTENCIA CONCOMITANTE ]. Introduccion.....l Antecedentes historicos.....l 5 OBJETIVO MATERIALES Y METODOS I. Animales Tumores Volumen tumoral.....2] 4. Ensayo de resistencia concomitante.....2] 5. Ensayo de neovasculan'zacion.....2] ó. Cuantificacion de la proliferación vascular Microvascularización Medio de cultivo

7 9. Células en cultivo IO.Drogas anti-inflamatorias I I. Ensayo de incorporacion de timidina tn'tiada Unidades inhibitorias Adhesividad y fagositosis de celulas adherentes pen'toniales.....zó 14. Adhesividad de polimorfonucleares l5. Agregación de plaquetas Ió. Diálisisdel Liofilizacion Cromatografia en columna Digestión enzimática Columna de intercambio ionico Cromatografia en capa delgada Cromatografia liquida Análisisde aminoácidos.....3l 24. Secueciación Espectrometn'a de masa RESULTADOS I. RESISTENCIA CONCOMITANTE INDUCIDA POR TUMOR LB EFECTO DE LA RESISTENCIA CONCOMITANTE INDUCIDA POR EL TUMOR LB SOBRE METASTASIS ESPONTANEAS MECANISMOS DE LA RESISTENCIA CONCOMITANTE l. Mecanismo directo Mecanismo indirecto CORRELACION ENTRE RESISTENCIA CONCOMITANTE Y ACTIVIDAD SERICA Resistencia concomitante contra metástasis experimentales Resistencia concomitante contra metástasis espontáneas.....4l 5. EFECTO DEL SUERO DE PORTADORES DE TUMOR LB SOBRE PROLIFERACON Y/O FUNCION DE CELL LAS NORMALES.....4l

8 6. ORIGEN DEL FACTOR SERICO AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DEL FACTOR SERICO l. Diálisis Analisisde sustancias tóxicas Tratamientos enzimáticos Sephadex G Sephadex G-IS Ionograma Cromatografia en capa delgada Intercambio oníco Cromatografia liquida Análisisde aminoácidos l l. Secuencia de aminoácidos Espectrometría de masa DISCUSION BIBLIOGRAFIA

9 ABSTRACT Observations from both clinical and experimental oncology have demonstrated that surgical removal of a primary tumor is usually followed by an explosive growth of metastases which were not apparent at the time of excision. These observations suggest that the primary tumor may prevent or retard the development of its own metastases. The experimental model for the study of this phenomenonis known as concomitant resistance. In this work we have shown that LB tumor-bearing mice were able to inhibit the growth of experimental and spontaneous metastases from both the proper LB and the unrelated highly metastatic C7HI tumor. The presence of the LB tumor induced a tumor dormant state in which metastatic cells remained alive but without apparent growth; reciprocally, when the LB tumor was removed the suppression exerted by the local LB tumor disappeared and metastatic growth was rapidly evident. Presumably, metastases were inhibited by two different but complementary mechanisms: a direct one, affecting the proliferation of the tumor cells themselves and an indirect one affecting tumor vascularization. Both mechanisms would be mediated by a low molecular weight factor ( D) found in the serum of LB tumor-bearing mice. This factor proved to be resistant to heat and to variations of ph, exhibiting two peaks of absorption at 215 and 266 nm. This molecule would have a free tyrosine followed by one or more glycosilated tyrosine. Origin of this factor is apparently associated with the inflammatory response mounted by the host against the tumor. The final characterization of this factor could be eventually of some value to assay in the future new therapeutic approaches against cancer.

10 RESUMEN Observaciones clinicas y experimentales han demostrado que en muchas ocasiones la extirpación de un tumor va seguida de un rápido desarrollo de metástasis que no eran aparentes al tiempo de 1a misma. Esto sugiere que 1a presencia de un tumor primario ejerceria un control inhibitorio sobre las metástasis. El modelo experimental para el estudio de este fenómeno es conocido como resistencia concomitante. En este trabajo hemos demostrado que ratones portadores de un tumor LB eran capaces de inhibir el crecimiento de metástasis experimentales del propio tumor LB y metástasis espontáneas de otro tumor no relacionado (el altamenete metastásico C7HI). La presencia del tumor LB induce en estas metástasis un verdadero estado de tumor dormido en el que las celulas metastásicas permanecen vivas pero sin crecimiento aparente; recíprocamente cuando el tumor LB es extirpado, su acción desaparece y ello ocasiona un rápido desarrollo de las metástasis. Presumiblemente las metástasis son inhibidas por dos mecanismosdiferentes pero complementarios, a saber: un mecanismo directo que afecta la proliferación de las propias celulas tumorales y un mecanismo indirecto que afecta la neovascularización tumoral. Ambos mecanismos estarian mediados por un factor de bajo peso molecular ( D) hallado en el suero de ratones portadores de LB. Este factor probó ser resistente al calor y a amplias variaciones de ph, con máximos de absorción a 215 y 266 nm. Esta molécula parece poseer en su estructura una tirosina libre seguida de otra/s tirosinas modificadas, posiblemente por azúcares. Su origen parece estar asociado más a la respuesta inflamatoria que monta el huésped en presencia del tumor LB que al tumor LB por si mismo. La definitiva caracterización de este factor podria eventualmente ser de valor en el futuro para ensayar nuevas terapéuticas en la lucha contra el cáncer.

11 INTRODI'CCION GENERAL l. CONCEPTO DE NICOPLASH: Se denomina neoplasia al crecimiento proliferativo relativamente autonomo de un tejido (l). El primer componente de esta definicion. a saber. el caracter de crecimiento proliferativo indica un aumento en el numero de celulas debido a una tasa promedio de division mas rápida o a una tasa promedio de muerte mas lenta que las de las celulas del tejido normal. Si se compara el grado de crecimiento de una celula neoplasica respecto de su contraparte normal cuando esta esta en etapa proliferativa, se observa que la celula neoplasica puede crecer mas rapido, igual ó mas lentamente (como es el caso de las neoplasias de intestino delgado y leucemias crónicas) que las celulas normales que le dieron origen. Pero en promedio. tomando la vida total de un tejido, es decir la suma de las etapas proliferativas y no proliferativas, el grado de crecimiento de las celulas neoplasicas es mayor porque mientras las celulas normales estan limitadas en su crecimiento por la homeostasis del organismo. las celulas neoplasicas no lo estan y continuan creciendo. La replicaeion aumentada de las celulas l'orma parte de la definicion operacional de una neoplasia; sin embargo las celulas neoplasicas pueden permanecer mucho tiempo en el huesped sin que sea demostrable la existencia de división celular (2). El segundo componente de la definición de neoplasia. a saber. el termino autonomo indica que el cancer no esta sujeto a las reglas de regulacmn que gobiernan a las celulas indixiduales _\'al conjunto de interacciones que estas poseen con el resto del organismo. Respecto del adjetno "relativo". este indica que dicha autonomia no es total. En algunos casos la autonomia que posee una neoplasia es sólo referida al tejido de origen. Finalmente. el tercer componente de la definicion es el termino tejido lïste termino indica que una neoplasia solo puede ser definida en un organismo

12 multicelular. Por esta definicion, los organismos unicelulares estan libres de esta enfermedad Tumor El termino tumor (tomado del latin tumor, que significa hinchazón) es mucho mas amplio _\'abarca a las masas parasitarias, granulomatosas _\'abscesos crónicos ademas de las neoplasias. Sin embargo frecuentemente se utilizan los terminos tumor _\' neoplasia como sinónimos. y esta convención sera usada tambien en el presente trabajo. pueden ser: La clasificación de neoplasias posee gran utilidad en la prognosis. Estas a) benignas. cuando se restringen al tejido en el cual se originan. permanecen encapsuladas, altamente diferenciadas y con pocas o ningunas anaplasias. b) malignasi si son capaces de invadir otros tejidos cercanos o distantes (metástasis) y no presentan encapsulamiento. Las neoplasias malignas reciben el nombre de cancer. Como puede verse. la mayoria de las diferencias entre tumores benignos y malignos son relativas. Quizas la capacidad de dar metastasis sea la única realmente critica Clasificación de las neoplasias malignas Los canceres se pueden clasificar segun un criterio histogenetico. en: ll carcinomas: tienen su origen en los epitelios. o sea en las capas de celulas que reeubren la superficie del cuerpo _\'las que forman las glándulas. 3p sarcomas. surgen a partir de las estructuras de sosten. derhadas del mesodermo. como hueso. musculo. etc. 3) leucemias y linfomas: se originan a partir de las celulas hematopoyeticas de la medula Osea _\ ganglios linl aticos. Cuando el origen de un cancer es mttltiple se lo denomina teratoma.

13 2. METASTASIS: 2.1. Definición de Nletástasis Como se ha descripto, el cancer se define por el crecimiento invasivo de las celulas malignas. Esta invasion puede darse en tejidos adyacentes a aquel en el cual surgieron. o en sitios distantest sin continuidad con la masa que le dio origen. En este ultimo caso se habla de metástasis. El movimiento de las células tumorales desde el tumor primario a órganos distantes y el subsecuente desarrollo de las metástasis es uno de los aspectos mas devastadores del cancer (3) Incidencia y Mecanismo La cascada de eventos en la progresión de un tumor metastásico se resume en el Esquema l. En este sentido la iniciación y promocion del tumor primario son seguidas por la transición de un estado de tumor in situ a localmente invasivo y luego a tumor xascularizado (4-7). Los capilares neoformados poseen una estructura diferente a la de los normales. Esto hace que sean facilmente invadidos por las celulas tumorales dentro de la masa del tumor primario. Tambien vasos preestablecidos pueden ser invadidos por las celulas tumorales. Estas celulas tumorales viajan por el drenaje venoso en forma aislada o formando trombos. Sin embargo menos del 0.U o de estas celulas son capaces de generar metastasis. Los tumores carecen de sistema linfático dentro de su masa. por lo tanto la comunicacion de las celulas tumorales con los canales linfáticos ocurre soio en la periferia del tumor. Las celulas tumorales que entran al sistema Iinfatieo llegan a un nodulo cercano donde son detenidas en los sinos subcapsulares. Pero entre los lo _\'los 60 tninutos despues del arresto inicial. algunas celulas tumorales escapan y entran al sistema linfático eferente _\' exentualmente terminan en el sistema de drenaje venoso debido a la ethtencia de numerosas conexiones infzttico-sanguineas. Por lo tanto Ia diseminacion

14 Esquema 1 Resumen de los procesos que llevan a! estabiecímíemc} de metastasis globulos rojos 7.313? 1I ' : 5 ; globulos blancos celulas tumorales capndm TUMOR PRIMARIO TRANSPORTE TUMOR SECUNDARIO

15 linl'atica y sanguínea ocurren en paralelo. Las celulas tutnorales circulantes solas o en trombos -asociados o no a leucocitos. l'ibrina o plaquetas- son arrestadas en la microx'asculatura del organo blanco. anclandose a la superficie endotelial intacta o a regiones donde existe exposicion de la metnbrana basal subendotelial. Una vez que las celulas tumorales se han anclado, las celulas endoteliales adyacentes se extienden sobre las celulas tumorales y las separan de la corriente sanguinea. Luego se observa la disolución local de la membrana basal y el movimiento de las celulas tumorales con sus pseudopodos a trave's de la membrana degradada. Este paso es seguido por la completa extravasación de la celula tumoral y el re-establecimiento del flujo sanguíneo del vaso. Las celulas tumorales que logran extravasar proliferan como colonias pero requieren la formacion de neovasos para crecer mas alla de l o 2 mm de diametro. Cuando la colonia es suficientemente grande puede comprimir el vaso sanguíneo. causando daño mecanico al endotelio. De esta manera las celulas tumorales pueden re-introducirse en la corriente sanguinea y dar origen a nuevas metástasis. Sin embargo existen numerosos reportes clinicos sobre la existencia metastasis dormidas (8). Mas aun. un tercio de la mortalidad en el cancer de mama se observa luego de 5 años dela de remocion del tumor primario debido a la existencia de metástasis ocultas al momento de la extirpación del tumor primario. 3. VASCI'l..\RlZ.\('I()\ Tl.".\l()R.\L 3.l. Introducción La prolil eracion de vasos sanguíneos es esencial para el normal crecimiento y desarrollo de los tejidos. En el adulto. es un evento poco frecuente. Pero se pueden encontrar excepciones en el sistema reproductuo t'emenino. donde se desarrolla neontseularizaeton en el l'olieulo durante ei

16 desarrollo, en el cuerpo Iuteo durante la ovulación y en la placenta durante la preñez. Estos periodos de angiogenesis son relativamente cortos y altamente regulados. Tambien se verifica el desarrollo de neovasos durante el proceso de reparación de una herida. Por otro lado, la falta de control sobre el desarrollo de neovasos contribuye a una gran variedad de enfermedades. Por ejemplo, el crecimiento de tumores sólidos es dependiente de la vascularización, y en la retinopatia diabética, la vascularización de la retina, frecuentemente lleva a la ceguera. Los neovasos se forman a partir de prolongaciones de vasos ya establecidos, asi como de venulas y otros capilares. Este fenómeno sigue una serie de pasos determinados (8,9). Durante la fase inicial del desarrollo capilar, la membrana basal de las células endoteliales (CE) de los vasos sanguíneos es degradada. Esta es mediada por enzimas proteolíticas, siendo las más conocidas el activador del plasminógeno y las colagenasas, liberadas por las CE en respuesta a los factores angiogenicos (lo). Existen tumores que directamente pueden degradar la membrana basal mediante endoglicosidasas que actúan sobre el heparan-sulfato, componente mayoritario de los glicosaminoglicanos (GAGs) constituyentes de la membrana basal (ll). Cuando la membrana basal está degradada. las CE empiezan a migrar hacia el espacio pre-vascular y luego proliferan. Subsecuentemente, las CE forman la luz del capilar por un mecanismo que aún permanece poco conocido (12). En los pasos finales, los pericitos (fibroblastos y en menor medida adipocitos y osteocitos) llegan a los capilares recien formados y una nueva membrana basal es sintetizada (presumiblemente por ambos tipos celulares -pericitos _vce) estableciéndose asi un nuevo capilar ( 3). 3.l.l Diferencias entre vasos tumorales v normales. Hace ya tiempo se ha descripto la asociacion entre crecimiento angiouenesis ( l-l). Goldman llamo la atencion sobre: tumoral y

17 :i) la LliiállílClÚll. li) la icclcrada prulil'cracion _\'Cl cl leferrü llu ll E'C'C LIEdl de los C:l ) l;ll" \ {um-amics : 352 l): ii- dias le-jl"-. lclt)l1c.\ lcmgn anas :x k wslcriorcx sc ha cnmplctzidi ÉL!dcscz'lpcion del desarrollo ilc lox' capilarcs lumm ulgs il<>.lï"';. {Sins alan Cilll'illllClllc cxpucslm cn un i'ahziin ill: l 'iraci. lila cn g- caiaá riconii'umm la «guion; «.lhllilclollcnlr: ascularzxzicmn ul: un mii-ju nurmal _\ \;lscl llli'l/11cl(líltumoral -l,a prolil'crziciun cmpicza mucho anlcs cn un tumor implantado quc. n un lcliido normal implantado. -l)uranlc cl curso dc la msculurización del [ejido normal. sc ohscna una gradual L fcïcíïclélclóhcnlrc iricriiilas. prc-arlcriolas. capilares. wnulas _\' xcnas. l-ïnconlraposicion. muchos dc los vasos tumorales consislcn cn canales cndotclialcs dc diametro variable. con poca o ninguna diferenciación. -i\ dil'crcncia dc los cxplanlos dc tejido normal, muchos dc los capilares lumoralcs sc colapsan instanlancamcnlc después dc la mucrlc del huésped por la reduccion dc la presión arterial. Iixislcn varias dil crcncms respecto dc la funcionalidad cnlrc los xasos umuralcs _.'los olixcn'adm cn lcliidos normales. La hipotensión inducida por :lgcnlcs l arinzicnlogicos CHI al colapso dc los capilarcs tumorales. presumihlcmcnlc dchido a la "allailc membrana lmsal a ln largo dc los capilarcs inclil'crcnuados _\'a la presión lc a 1th1 tumoral l I M. La misma cxplicacmn ha xldü mili/ada para Justificar la lmada permeabilidad asociada a los camlurcs ziiinoralc; (2'11; Por mira parte >c "ia dcmoslrado un aumcnïo dc Fil-4h xccm un :1 { í't liigl'ilciull Nik-l:ndníclin..;>pa:; :' n lllïihh'csrupccm lo unicniiíu Miki quam :mrmalgs :_. Sin Cllll.!i'j_.'0la iii'opm'cmn dc thullli l/lichh. {cuina ixniinujnt son g? nur-siian lla-é. inailn (Limnral i_"_

18 3.2. Factores inductores (angiogénicos) e inhibidores dela vascularización. Como ya hemos descripto, el crecimiento de los tumores sólidos es dependiente de la vascularización pero los tumores no estan vascularizados en el comienzo de su desarrollo (2 39). De este modo pueden permanecer en estado de tumor in situ por meses e inclusive años sin vascularizarse y en consecuencia limitados a unos pocos milímetros de volumen. Algunas celulas tumorales cambian luego a un fenotipo angiogenico e inducen la vaso proliferación (-l 10%) que sustenta el desarrollo de las celulas que inducen vascularización asi como de las que no lo hacen (30 31). La expansión dela masa tumoral se realiza tanto por Ia perfusión de los neovasos a través del tumor como por la estimulación paracrina de un gran número de factores de crecimiento y proteinas de la matriz producidas por el endotelio de los neovasos (32,33). El cambio de las celulas tumorales a un fenotipo vascularizante depende del balance entre factores angiogenicos y factores anti-angiogenicos liberados tanto por el tumor como por celulas normales circundantes tales como macrófagos, linfocitos y fibroblastos (34.35). Ahora bien, el desarrollo de vascularización tumoral puede deberse tanto a la sobreproduccion de factores angiogenicos como a la regulacion negativa de factores inhibidores de la vaso proliferación. Respecto de los procesos tumorales es posible que ambos mecanismos esten presentes (36) l. Factores angioue'nicos La primera demostración de la naturaleza de los factores angiogenicos proviene de los trabajos en donde se aislaron factores derivados de tumor con capacidad de generar angiogenesis tanto in vitro como in vivo (34-40). H0} existen numerosos ensayos que miden la capacidad de diferentes factores para inducir angiogenesis. Estos factores angiogenicos pueden agruparse de la siguiente forma:

19 Factores de bajo peso molecular. A). Factores quimiotacticos: son factores que estimulan la migración pero no la proliferación de CE (4 ). En general se trata de polipeptidos de 2000 I4000 D. Estos factores han sido aislados de tejidos en reparación y en culti\os de macrofagos in vitro en respuesta a la hipoxia (42) v al lactato (43). Se cree que son los macrófagos presentes en los tejidos dañados los responsables actividad in vivo. de la B). Lipidos: La caracterización quimica y el uso de inhibidores sugieren que una mezcla de prostaglandina E. y E; serian responsables de esta actividad (44-47). Los niveles de prostaglandinas son elevados en tumores, exudados inflamatorios, cicatrizaciones y en sobrenadantes de macrófagos activados (47). C). Factores angiogenicos derivados de tumor: son compuestos de bajo PM ( D) que estimulan la proliferación de las CE (38-40). Una de estas moleculas ha sido recientemente caracterizada como nicotidamida (48,49). Factores de crecimiento. Algunos factores de crecimiento o migración de las CE fueron descriptos durante los años 70. Entre los primeros factores aislados estan el factor basico de crecimiento de fibroblastos (bfgf) aislado de cerebro (50-53). el factor de crecimiento de las celulas epiteliales (ECGF) aislado de hipotalamo (53). el factor de crecimiento de condrosarcoma (ChDGF) (54) _vel factor acido de crecimiento para fibroblastos (afgf) (55). Factores polipeptidicos. A). Angiogenina: fue el primero en ser purificado a partir de medios condicionados de cultivo de adenocarcinoma humano (56-59). Bl. Factores transformantes del crecimiento (TGF): los TGF son polipcptidos que fueron primero identificados por su habilidad para transformar el fenotipo dc celulas normales. Entre ellos el TGlÏ-a _\' el EGF (factor de

20 crecimiento epidermieo) estimulan la proliferación de las CE en los microcapilares (oo-63). Otros como el TGF-B inducen la formacion de neovasos _vla produccion de colageno por los fibroblastos ademas de ser un potente factor quimiotactico de los monocitos (64-66). Sin embargo, otros trabajos relacionan al TGF-B con la inhibición de la proliferación de las CE in vitro _vantagoniza la actividad mitogenica de bfgf en forma no competitiva (67.68) Nuevos factores: Recientemente, dos nuevos factores angioge nicos han sido identificados. Ambos estan. estructuralmente relacionados con el factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF). El primero es el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) tambien conocido como factor de permeabilidad vascular (69-70). El VEGF es un mitógeno especifico de las celulas endoteliales in vitro y posee actividad angiogenica in vivo. Posee dos formas pequeñas (VEGF 3, y VEGF 65) que son secretados como proteinas, pero dos formas mayores (VEGF W, y VEGF.m) se unen a los proteoglicanos que contienen heparina en la membrana de las celulas o en la membrana basal (70). Ademas, como factor de permeabilidad vascular permite la extravasacion de proteinas como el fibrinogen para formar el gel de fibrina extravascular que es el sustrato optimo tanto para el crecimiento delas celulas tumorales como para las celulas endoteliales. Cabe señalar que se ha demostrado Ia induccion de.vegf en las regiones hipóxicas de glioblastomas multiformes (70). lïl segundo factor es el factor de crecimiento placentario (PlGF). el cual fue aislado de placenta _vcelulas de coriocarcinoma humano (7 ). Este factor presenta un 5400 dc homologia con el VEGF. A pesar de los exitos logrados con cl tratamiento anti-angiogenico en algunos tipos tumorales 25) la existencia de tantos factores angiogenicos hace dificultoso el intentar prevenir la angiogenesis tumoral bloqueando factores angiogenicos indniduales. De hecho enistcn hibridomas que secretan grandes

21 cantidades de anticuerpos anti-fgf y sin embargo. la presencia de otros factores angiogenicos hace que el tumor \ dsculle ÍCCy desarrolle. Sin embargo. el uso de factores anti-angiogenicos parece abrir una nueva puerta a la terapeutica Factores inhibidores dela vascularización Los antagonistas de la angioge nesis han sido divididos en dos categorias; aquellos que inhiben la producción de factores angiogenicos y los que inhiben la proliferación de celulas endoteliales. Se ha demostrado que los interferones (INF-a e INF-B) inhiben la señal angiogenica (72,73). Sin embargo. los diferentes tumores y hasta diferentes subpoblaciones de un mismo tumor pueden o no responder al lnf. Por otra parte. se ha observado que el factor plaquetario 4 (PF-l) producía zonas avasculares en la membrana coriónica de embrión de pollo (74). El PF-l inhibe la proliferación de las celulas endoteliales in vitro, sin embargo las concentraciones usadas no pueden ser alcanzadas in vivo. Otro inhibidor de la angiogenesis fue recientemente extraido de cartílago y se lo denominó TlMP (inhibidor de las metalo-proteinasas) y actua inhibiendo las colagenasas (75-77). Luego fue descripta una segunda molecula con actividad inhibidora de las metaloproteinasas. denominada TlMP-2 (78). Existen observaciones acerca de factores inhibidores de la angiogenesis de bajo peso molecular. Se ha conseguido inhibición dela angiogenesis con una combinación de esteroides _\'un sustituto sintetico de la heparina llamado B-ciclodextrina e tetra-dcca sulfato (8] t. La penicilina (83). los analogos de la vitamina D3 (83). el metabolito de herbtmicina A (84) y la anti-colagenasa minociclina (85) también han sido descriptos como factores antiangiogenicos. Mas recientemente. derhados del metabolito fungico denominado Fumigalina. demostro poseer capacidad de inhibir angiogeneis _\' suprimir el crecimiento de tumores xenogeneicos en animales nude (86.87).

22 Otros autores han descripto que los glucocorticoides. _ven especial la ó metilprednisolona. inhiben la angiogenesis inducida por tumores _votros materiales (88-90). El enfoque mas reciente en la busqueda de factores anti-angiogenicos esta orientado hacia los reguladores negativos endógenos de la vascularizacion. Asi se han sido descriptos tres nuevos factores: el primero es la trombospondina. producto de un gen supresor que posee actividad anti-angiogenica; este factor es producido constitutivamentc por las celulas normales pero su produccción decae al 4% durante el proceso de tumorigenesis (79,9],92). EI segundo factor es el inhibidor de la angiogenesis derivado de glioma. que se encuentra regulado negativamente en el tumor de cerebro en humano, pero cuya producción se restitu_ve cuando se vuelve al fenotipo p53 normal (80,93). Por último, el mas reciente de los factores inhibidores de la neovascularización es la angiostatina, una proteina de aproximadamente 38kD derivada del plasminógeno, cuya actividad ha sido relacionada con el estado de tumor dormido que induce sobre sus metástasis el carcinoma murino de pulmón de Lewis (94). Cabe señalar que este factor puede actuar tanto en forma paracrina como endocrina inhibiendo especificamente la proliferación de las celulas endoteliales _vque su accion desaparece despues de la extirpación del tumor primario. permitiendo el rapido desarrollo de las metastasis que hasta ese momento permanecían en estado de tumor dormido. 4..\lE(.-\. IS.\I()S RESPONSABLES DEL ESTADO DE TlÏNIOR DORHIDO 4.l. Definición del estado de tumor dormido. El estado de tumor dormido es aquel en el cual las celulas tumorales persisten por un largo tiempo en un huesped clinicamente normal con escaso o ningun incremento en su pohlacion celular. Las celulas tumorales en este estado

23 pueden estar detenidas en un determinado punto del ciclo celular. o bien poseer igual grado de muerte _\'de proliferación (95 96) Mecanismos. Los mecanismos propuestos para la permanencia de las celulas en estado de tumor dormido son: l. lnmunidad mediada por células (97-102) a. Citoliticos b. Citostaticos 2. Respuesta inmune humoral (l03,l04) a. Anticuerpos citotóxicos b. Citoquinas inhibidoras del crecimiento tumoral 3. No inmunes a. Factores solubles que inducirian arresto mitótico b. Factores solubles que inducirian diferenciación 4. Avascularidad _\'secuestro tumoral (los-l lo) 5. Ausencia dc factores especificos requeridos para el crecimiento tumoral: a. Hormonas ( l l l-l 14) b. Factores de crecimiento producido tanto por el huesped como por el tumor ó. Actix'acIOn de una secuencia de genes supresores l l ló_l l7t. a. Estado de iniciación cn la carcinogónesrs quimica De los mecanismos analizados cuatro son los que resultan de mayor importancia en los modelos animales in vivo CFCCIIHICHIO. (Il Dependencia constitutiva de las celulas tumorales de factores de

24 El caso mas conocido es el de los tumores hormono-dependientes. La detención del crecimiento se elimina cuando ciertas variantes de celulas tumorales se vuelven independientes de esos factores o cuando son capaces de producirlos ellas mismas. volviéndose tumores autónomos. (2) Avascularidad y secuestro El crecimiento progresivo de los tumores sólidos en su lugar primario o en sitios distantes depende de la neovascularización (los-llo). Los nódulos tumorales pequeños no desarrollan mas allá de l o 2 mm de diametro sin vascularización. La neovascularización tumoral depende de factores angiogenicos producidos por las celulas del huésped o por las propias celulas tumorales (lll). Los factores producidos por las celulas del huésped estan regulados, en algunos casos, por sustancias derivadas del tumor. Así el estado de tumor dormido inducido por ausencia de vascularización depende de un complejo sistema de interacción entre las celulas tumorales. del huesped y las celulas (3) Mecanismo inmunológico Existen una gran variedad de mecanismos que pueden ser identificados como responsables del estado de tumor dormido. Los mecanismos inmunológicos actuarian lisando un número de celulas tumorales igual al que se produce por proliferación (95404). La evidencia fundamental se basa en el alto porcentaje de aparicion de ciertos tumores en individuos inmunosuprimidos. En los modelos experimentales en los que se usan tumores de inmunogenicidad detectable. generalmente inducidos por carcinógenos quimicos o virales. el mecanismo inmunológico juega un papel fundamental en la regulación de su crecimiento. Ademas restringe o suprime el desarrollo de las celulas remanentes a la extirpación de un tumor. Sin embargo. en los modelos en los que se utilizan

25 tumores de baja o nula inmunogenieidad. los mecanismos aqui descriptos no ejercerian un efecto importante. (4} Factores inhibidores Se han descripto factores inhibidores de la proliferación de celulas tumorales i_n gtr_o tll9,l2())_ Dichos factores provienen de diferentes tejidos. normales _v neoplasicos (130). del sobrenadante de cultivos celulares y del suero de animales o pacientes portadores de tumores ( ). En ningun caso se intentó correlacionar este hecho con la inducción del estado de tumor dormido. es decir. con metástasis no aparentes al momento de la extirpación del tumor primario. quirúrgica Los mecanismos responsables de la terminación del estado de tumor dormido se resumen a continuación: A.Supresión inmune Al Extrinseca a. Anestesia y procedimientos quirurgicos ( l25-l27) b. Infección con agentes inmuno-supresores c. Drogas citotóxicas _vglucocorticosteroides A.) lntrinsecas a. Caida de las defensas asociada a la edad b. Factores causantes de la regulación negativa de la respuesta inmune producrdos tanto por las celulas del huesped como por las celulas tumorales. B. Estimulación inmune que lleva a la regulación negativa de la respuesta inmune. C. Suplemento de factores de los que las celulas tumorales dependen constitutivamente. D_ Vascularización del tumor (128). l'j. Mutaeion _vproliferación de una variante inmuno-resnstente.

26 F. Activación de oncogenes adicionales. (ll7) Un mecanismo que cumple con varios de los items antes descriptos es la inflamación. Existen trabajos en los que se generan inflamaciones en el area de un tumor dormido _v este retoma su crecimiento. Este fenomeno ha sido denominado oncotaxis ( l39). 5. EL FENOMENO DE LA RESISTENCIA CONCOMITANTE 5.1. Introducción La experiencia clinica revela que en muchas ocasiones, la extirpación de un tumor va seguida de un rapido desarrollo de metástasis que no eran aparentes al tiempo de la misma (96-lOl). Los estudios realizados en estos casos sugieren que la presencia de un tumor primario ejerce un control inhibitorio metástasis. sobre las El modelo experimental para el estudio del fenómeno de control de metastasis por el tumor primario es conocido como resistencia concomitante. Considerando los estadios descriptos en el Esquema l para el establecimiento de una metástasis. veremos que este modelo experimental sirve para el estudio de los factores microambicntales a los que se enfrenta la metastasis experimental desafio 2 ") luego de la implantación _vque pueden llevar a la induccion del estado de tumor dormido. El microambiente sera la resultante de factores que actuan por difusion v otros que actuan localmente por ejemplo la \ascularización. 5.2 Antecedentes históricos lín el año 1906 Paul Ehrlich (ISO) describio el l cnomeno de resistencia concomitante el crecimiento segun el cual un individuo portador de un tumor inhibe o retarda de un segundo implante con celulas dc ese mismo tumor cuando este implante es realizado en un sitio distante al del crecimiento primario. Dos

27 años mas tarde Bashford Io denominó "inmunidad concomitante". en la creencia de que se trataba de un rechazo inmunológico. Postuló entonces que el tumor pritnario dispara una respuesta inmune tardía. incapaz de impedir la progresión de dicho tumor. pero suficiente para neutralizar el implante secundario ( 3 ). Este enfoque fue apoyado en los años '60 con el descubrimiento de los antígenos de transplante especificos de tumor (TSTA) en tumores inducidos por carcinógenos quimicos y virus oncogenicos (l32). Sin embargo. se ha establecido que la resistencia concomitante puede ser inducida tanto por tumores inmunogenicos como por tumores no-inmunogenicos, por lo que la postulación del control inmunológico no puede ser generalizada ( ). Varios autores han demostrado que los mecanismos inmunológicos clasicos. principalmente mediados por linfocitos T y macrófagos podrian explicar, al menos en parte, la resistencia concomitante generada por tumores murinos fuertemente inmunogenicos inducidos por carcinógenos quimicos o virales ). No obstante. respecto de tumores con baja o nula inmunogenicidad. la naturaleza del fenómeno permanece casi completamente desconocida; todos los datos relativos a su etiologia obtenidos a partir de experimentos en ratones nude y eutimicos son esencialmente negativos. sugiriendo que los linfocitos T no cumplen un rol significativo ( 43). Dado que Ia enorme mayoria de los tumores espontáneos de rata. ratón _\' presumiblemente humanos. pertenecen a esta categoria. resulta de suma importancia estudiar Ia resistencia concomitante inducida por tumores con baja o nula inmunogenicidad. En trabajos prexios (l37-l-ll) realizados en nuestro laboratorio se ha demostrado que la resistencia concomitante inducida por varios tumores murinos no-inmunogenicos operaba a traves de un mecanismo citostatico sin la participación local de celulas del huesped; en efecto, en el implante secundario que no crecía como consecuencia de la resistencia concomitante. el examen histológico reveló la presencia de celulas tumorales bien prescrx'adas sin ningun

28 signo de necrosis _vsin ninguna infiltración con celulas del huésped. en estado de tumor dormido. contrastando drásticamente con un fenomeno de rechazo inmunologieo convencional. Mas aún. las celulas de bazo _vganglio de ratones con resistencia concomitante. no mostraron acthidad citotóxica sobre las celulas tumorales in vitro e in vivo. Hemos demostrado asimismo que los sueros de ratones portadores de 5 tumores no-inmunogenicos exhibian in vitro una actividad inhibitoria de la proliferación tumoral que era proporcional a la intensidad de la resistencia concomitante generada por dichos tumores (l 18,142). Experimentos realizados usando ratones en parabiosis sugieren que esta actividad inhibitoria puede cumplir un rol causal en la inducción de la resistencia concomitante. En efecto, se vio que un implante tumoral no crecía en un raton normal unido en parabiosis con un ratón portador de tumor; esta "imitación" de la resistencia concomitante se correlacionó actividad antitumoral en el suero del ratón normal transferida con la presencia de por circulacion cruzada desde el ratón portador de tumor. Mas aun, cuando ambos miembros del par en parabiosis fueron separados. el titulo de la actividad antitumoral cayo rapidamente en el suero del raton normal, en el cual las celulas del implante tumoral que habian permanecido hasta ese momento en estado dormido. comenzaron a crecer. Estos experimentos sugieren que la resistencia concomitante dependeria de un nivel alto _\'persistente de actividad inhibitoria en suero. Esto implica que esta ilcihldle inliibitoria podria eventualmente ser utilizada como herramienta terapeuttca para controlar el crecimiento tumoral in vi\o.

29 OBJETIVO Observaciones clinicas y experimentales han mostrado que en muchas ocasiones. la extirpación de un tumor trae como consecuencia el crecimiento "explosivo" de metástasis que no eran detectables en el momento de la extirpación y que por Ió tanto pertnanecian en un estado de tumor dormido. Esto ha sugerido que el tumor primario ejerce un control inhibitorio sobre sus propias metástasis. El modelo experimental que representa dicho fenómeno es conocido como resistencia concomitante (RC) y se define como la inhibición de un implante tumoral secundario en un individuo portador de tumor. En este trabajo. utilizando el modelo de resistencia concomitante inducido por el tumor LB en ratones BALB/c, nos hemos propuesto los siguientes objetivos: A). Estudiar si el efecto inhibitorio del tumor primario sobre las metástasis experimentales se ejerce a traves de mecanismos: A-l). Directos. por inhibición dela proliferación de las propias celulas LB implantadas secundariamente. A-Z). lndirectós. a II'LHÓSde la inhibición de la neoxascularización del implante secundario. B). Aislamiento y caracterización del factor/es inductores tumor dormido de las metástasis experimentales. del estado de La comprensión del balance existente entre el crecimiento tumoral y la restricción del mismo en el estado de tumor dormido podria permitir el desarrolló de terapias que inclinen Ia balanza a t'ax'or del paciente. resultando en la prolongación del estado de tumor dormido.

30 MATERIALES Y METODOS Animales: Se utilizaron ratones BALB c de atnbos sexos (entre 3 y 5 meses). Estos se obtuvieron de nuestra colonia. y se mantuvieron con pellets de Nutric (Córdoba) y agua ad-libitum. Tumores: LB: Se trata de una leucemia Iinfoide que se originó espontáneamente en un ratón BALBac de ó meses, en nuestro bioterio. Se mantiene por pasaje subcutaneo en ratones singeneicos. Crece in-situ alcanzando un gran tamaño. Tiene una mortalidad de un 00% en un promedio de dias cuando se inoculan lo celulas. La dosis de ce lulas tumorales capaces de matar al 50% de los animales sc inoculados (DT 50) es de 1000 celulas y se ha mantenido a lo largo de los pasajes. Mediante ensayos de inmunización se ha comprobado que se trata de un tumor no inmunogenico. Por otro lado se ha demostrado en nuestro laboratorio que este tumor genera una resistencia concomitante muy intensa (ll8). Estudios realizados en el Weizman Institute de.lerusalen (Israel) por el Dr. Naor. han establecido que las celulas del tumor LB tienen las siguientes caracteristicas: el 95 o es Thy l+2+. Lyt 2. L3T4--'. CD25. gp7()-. H-2D-. H-2K--.-. l-e -. Como controles de especificidad de RC se utilizo el tumor C7lllzadenocarcinoma mamario altamente metastasico inducido en ratones BALBc por acetato de medroxiprogesterona. No presenta inmunogenicidad detectahle _\'no ejerce resistencia concomitante t l 8). Su DT 50 es de 000 celulas.

31 Determinación del volumen tumoral: El volumen tumoral se calculó de acuerdo con Ia fórmula descripta Attia y Weiss ( l-l-l) con determinaciones realizadas con calibre: volumen: 0.-l (abz) por siendo a y b los diámetros mayor y menor respectivamente. Ensayo de Resistencia Concomitante: Se realizo un implante tumoral subcutaneo (sc) en el flanco derecho de ratones BALB/c. A diferentes tiempos, se realizó un segundo implante sc con celulas del mismo tumor (desafio secundario) en el flanco izquierdo. contralateral al tumor primario en desarrollo. El grupo control sólo recibio el inoculo tumoral "secundario" en el flanco izquierdo. Se determinó la toma tumoral y cinética de crecimiento del implante secundario en función del volumen del tumor primario. Ensayo de ncovascularización: Varias suspensiones de celulas inductoras de x'ascularizacion tinacrol'agos. linfocitos. l'ibroblastos) fueron sc inoculadas en el l lanco izquierdo de a) ratones portadores de un tumor primario o b) ratones normales. Cinco dias despues. los ratones fueron sacrificados _vse separó cuidadosamente la piel de la zona inoculada con las celulas inductoras de \'ascularizaci0n tl'lanco izquierdo». La piel asi obtenida fue puesta bajo una lupa de diseccion lmagnificacit'm le). Las celulas inductoras de mscularización se obtuvieron de la siguiente l orma: ll N lacrotagos de exudado peritoneal (MEP): Ratones BALB c normales fueron injectados intraperitonealmente con l ml de tioglicolato al 300 Difco Laboratories. Detroit. Ml). Al cuarto dia se procedió al laxado del peritoneo con ll) ml raton de RPNll l()-l() lirio ((iilwco. Grand lsland. NY). Las celulas

32 peritoneales fueron lavadas dos veces _vresuspendidas en medio. La viabilidad celular fue rutinariamente mayor del 95%, medida por exclusión del colorante azul tripan. lil Lint'ocitos semi-alogeneicos de bazo (LSA): Los bazos de ratones híbridos Fl (BALBCXAKR) fueron presionados a traves de una malla metalica. La viabilidad de la suspensión celular fue determinada por el metodo de exclusión con el colorante azul tripan. iii) Fibroblastos embrionarios murinos (FE): se utilizaron embriones BALB,c de 14 dias. Luego de separar la cabeza y el higado, el embrión fue seccionado en piezas pequeñas y tratado con tripsina 0.25% por 15 minutos en agitación a 37"C. Luego se procedió a inactivar la tripsina en RPMI con 20% de suero fetal bovino. Las celulas se utilizaron en el segundo o tercer repique. Cuantificación dela proliferación vascular: Con el propósito de cuantificar los vasos que se forman por la inoculación de MEP, LSA y FE usamos una adaptación de un metodo ya descripto por otros autores ( 45). Brevemente, se coloca la piel correspondiente a la zona donde se han inoculado las celulas inductoras de vasoprolil eración bajo la lupa de disección. luego se toma una fotografia de un area de I cm: de piel. Las fotografias son proyectadas y se cuenta el número de vasos que convergen hacia la zona del implante. Es importante señalar que este metodo no permite cuantificar la reacción de neovascularización total, ya que existen gran cantidad de mlcl'0\ilsos que no se detectan por este metodo. Por este motivo cortes histológicos de las mismas muestras fueron estudiados por tecnicas de inmunohistoquimica utilizando anticuerpos anti-factor von Willebrand (anti l'actor \'lll) para detectar celulas endoteliales.

33 Estudio de la microvascularización: Los tejidos embebidos en parafina fueron fijados en formalina _\'luego desparafinados con xileno. Luego de la hidratación a traves de un gradiente decreciente de etanol. agua destilada y PBS, los cortes fueron incubados con una dilución I:l00 de anticuerpo policlonal contra antígenos relacionados al facror Vlll (Bio Genex. CA), durante 2 horas a temperatura ambiente. Anticuerpos anti-conejo biotinilados fueron usados para revelar el primer anticuerpo (Bio Genex). La tinción inmunohistoquimica se llevó a cabo por incubación con un complejo estreptovidina fosfato conjugado alcalino 1:15 (Bio Genex), y revelado con el sustrato de fucsina (Bio Genex ). Los controles negativos fueron tratados de igual modo pero usando PBS en xez de anticuerpos especificos contra el factor VIII. Medio de cultivo: Se utilizó RPMl l640 (Gibco,New York)suplementado con l b de antibiótico (estreptomieina. penicilina y anl otericina). Células en cultivo: Celulas Tumorales: il LB: Las celulas se extrajeron de un tumor LB i.p. que crece en forma ascitica. El procedimiento que se sigue es el siguiente: se lava el peritoneo con RPMl. se centrífuga a baja velocidad para precipitar las celulas que luego se resuspenden en RPM]. Las celulas LB asi obtenidas se siembran en placas de o pocillos a una concentración de l a 2xl0 l celulas por mililitro. durante horas en estufa gaseada a 37 C. lll C7Hl; A partir de un tumor C7Hl creciendo subcutaneamente eri ratones BALBvc. sc obtienen pequeños fragmentos. Estos son sometidos a digestion enzimática (se emplean colagenasa g; tripsina g fx albúmina 0.05 g por cada ll) ml de PBS) en agitación a 37 "C por 20 minutes

34 Mediante decantación en tubos Falcon por 20 minutos. se va separando el sobrenadante rico en t ibroblastos (celulas normales del estroma tumoral) del pellet enriquecido en celulas epiteliales. Estas se siembran luego en placas utilizandose como medio de cultivo RPMl sin rojo fenol adicionado con bicarbonato. hepes. 2-mercaptoetanol y l0 'ó de SBF. Células Normales: i) Linl ocitos murinos: linfocitos provenientes de ganglios linfáticos de animales BALB.c normales fueron sembrados en concentraciones de 4x10j y 2x105 celulas;ml, en placas de 96 pocillos (NUNC, Dinamarca) y estimuladas con Concanavalina A (Con A) en dosis de 0.25; l y 2 mgrml durante 48 horas. ii) Fibroblastos embrionarios murinos (FE): embriones BALBIC de l-l dias fueron obtenidos de hembras preñadas. Luego de separar la cabeza y el hígado, el embrión fue seccionado en piezas pequeñas y tratado con tripsina 0.25% por 5 minutos en agitación a 37"C. Luego se procedió a inactivar la tripsina en RPMI con 20% de suero fetal bovino. Las celulas se utilizaron en el segundo o tercer repique y se sembraron en placas de 96 pocillos en una concentración lxlo. celulas/ml. de iii) Celulas endoteliales (CE): Celulas endoteliales normales de vasos provenientes de cordón umbilical humano (HUVEC) obtenidas de la American Tissue Culture Corporation fueron cultivadas en RPM! adicionado con 30% de suero fetal bovino y 5 ng ml de bfgf. Las CE se sembraron en microplacas de 06 pocillos en una concentración de lxlo" celulasml. 'l ratamientós con drogas anti-inflamatorias in vivo: Ratones BALBc portadores de tumor LB de l: dias (3000 mm: de \olumen tumoral aproximadamente) y normales l'ueron inoculados durante tres dias consecutivos con 0.5 mg Kg (0.2 ml intraperitoneal) de lndometacina lndol < mglx'g (0.2 ml intraperitoneal) de acido nor-dihidro-guayaretico

35 (NDGA). 5 mgkg (0.2 ml intraperitoneal) de fenidona (Fen). lndo mas NDGA (0.4 mi intraperitoneal), mg/ratón de clorpromazina o l mgkg de prometazina. 24 _\'48 horas despues de la última inoculación los ratones fueron sangrados. Los sueros obtenidos fueron ensayados sobre la proliferación de celulas LB in vitro. Sueros: Tanto los animales portadores de tumor LB como los controles normales fueron sangrados a muerte por el plexo retro-orbital con una pipeta esteril. Se dejó coagular la sangre a temperatura ambiente durante 40 minutos. procediendose luego a dos centrifugaciones de 1500 y 2000 rpm. El suero asi obtenido se guardó a una temperatura de -20 0C hasta su uso. Los sueros fueron rutinariamente decomplementados previamente a su utilización en ensayos i_n vitro. Ensayo de incorporación de timidina tritiada: La proliferación de celulas tumorales y normales en 0,] ml de medio fue determinada en placas de 96 pocillos en presencia de 0.] ml de diluciones seriadas de suero o fracciones de suero de ratones portadores de tumor o de ratones normales. Inmediatamente se agregó un pulso de timidina tritiada (timidina-h ) (Dupont. NEM Research Products) en una concentración de lmci.ml. Las mezclas se incubaron en estufa gaseada (5% de CO3). a 37 C durante l8 a 24 hs. Las celulas se cosecharon con un cosechador automatico de celulas. y la radiactix'idad incorporada se midio en un contador Beta de centelleo liquido (Beckman.USAl. El porcentaje de inhibición se calculó de la siguiente manera: 'binhibicion= l -.\' cpm experimental)x 100 X cpm control

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